結核感染診断　T-SPOT検査　概要

実際の手技
1）ヘパリン加採血管採血　1本（0〜２歳：2mL、2〜9歳：4mL、10歳以上：6mL）
血液採取は、通常のヘパリン入り採血管が1本あれば十分で、18〜25℃で保管する。ただし、採血後8時間以内に検査ができない場合は、顆粒球を赤血球と交差結合させ単核球（リンパ球）をよりリッチに分離できるT-Cell Xtend試薬を検体処理直前に添加することにより、採血後最長32時間経過した血液でも検査できる。
2）全血から末梢血単核細胞（PBMC）層を分離
全血にRPMI-1640を加え希釈して、Ficoll3mLをゆっくり重層し、遠心して末梢血単核細胞（PBMC）層を分離し、25万/1wellとなるように細胞数をRPMI-1640で希釈調整する。この過程で免疫反応を阻害する物質や血漿中のIFN-γが除去され、バックグラウンドの非特異的反応が軽減される。
3）培養
抗IFN-γ抗体を固相したマイクロプレートのウェルに調整したPBMC検体を加え、結核菌特異抗原（パネルA抗原：ESAT-6とパネルB抗原：CFP-10）および陽性コントロール（PHA）、陰性コントロール（生理食塩水）を添加し16〜20時間培養（37℃、5％CO2）して反応させる。
4）IFN-γ産生スポットの計測
ウェルを洗浄した後標識抗体試薬を加える。ウェルを洗浄して非結合の抗体を除去後、基質試薬を加える。IFN-γを産生したエフェクターT細胞の痕跡が暗青色の「スポット（点）」として発現するのでこの数を計測する。

T-SPOTの判定
1.以下の計算式を用いて1）及び2）を算出
（パネルAウェルのスポット数）‐（陰性コントロールウェルのスポット数）・・・1）
（パネルBウェルのスポット数）‐（陰性コントロールウェルのスポット数）・・・2）
2.1で算出した1）2）の数値を用いて以下の判定基準に従って結果を判定する。
陽性：1）および2）の双方、あるいはいずれか一方が6スポット以上の場合
陰性：1）および2）の双方が5スポット以下の場合
判定保留：1）および2）の双方、あるいは双方の値の最大値が5〜7の場合
また、次の場合は「判定不可」のため再検査が必要となります。
・陰性コントロールウェルのスポット数が10を超える場合
・陽性コントロールウェルのスポット数が20未満となる場合